[银川产超广谱β-内酰胺酶菌株CTX-M型耐药基因的分布]内酰胺酶菌株

　　摘要：为了了解银川市部分医院临床分离的产超广谱β－内酰胺酶（ＥＳＢＬｓ）大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌中ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ基因分布情况，采用微量肉汤法测定分离自宁夏地区两家医院的４５株产ＥＳＢＬｓ的大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌对１０种抗菌药物的最低抑菌浓度，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）法及克隆测序分析其所产ＥＳＢＬｓ的基因型。结果显示４５株菌株对美罗培南全部敏感，对头孢噻肟、奈替米星、氨苄西林、头孢噻吩、头孢曲松、磺胺甲�唑、卡那霉素的耐药率均在６４％以上。４５株产ＥＳＢＬｓ菌株有４１株产ＣＴＸ－Ｍ型，其中ＣＴＸ－Ｍ－１４最多见，其次为ＣＴＸ－Ｍ－２８。
　　关键词：ＥＳＢＬｓ；基因型；大肠埃希氏菌；肺炎克雷伯菌
　　中图分类号：Ｒ４４６．５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2771-04
　　
　　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＣＴＸ－Ｍ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ
　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＥＳＢＬｓ ｉｎ Ｙｉｎｃｈｕａｎ
　　
　　ＤＵ Ｊｕｎ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＸ－Ｍ genotype ｉｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ β－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ（ＥＳＢＬｓ）－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｏｕｒ ｈｏｓｐｉｔａｌｓ ｉｎ Ｙｉｎｃｈｕａｎ ｏｆ Ｎｉｎｇｘｉａ． Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ） ｏｆ ４５ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ to 10 antibacterial agents ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＮＣＣＬＳ ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ（ＢＭＤ）． ＰＣＲ， ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｆｏｒ ＥＳＢＬｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ． Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ 45 ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ ｗａｓ １００％． Ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｒａｔｅ ｏｆ ＥＳＢＬｓ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＡＭＰ， ＫＡＮ， ＮＥＴ， ＳＭＸ， ＣＴＸ， ＣＲＯ， ＣＦ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ６４％． ４１ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ＣＴＸ－Ｍ genotype ＥＳＢＬｓ， ｍｏｓｔ ｏｆ ｗｈｉｃｈ was ＣＴＸ－Ｍ－１４ ｔｙｐｅ，next was CTX-M-28．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ β－ｌａｃｔａｍａｓｅ（ＥＳＢＬｓ）； gｅｎｏｔｙｐｅ； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ； Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
　　
　　随着第三代头孢菌素的大量使用，其耐药菌株也随之出现。经研究多数耐药性是由细菌产生超广谱β－内酰胺酶（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ β－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ，ＥＳＢＬｓ）所致，经过２０多年的研究，人们对该酶的认识不断深入。ＥＳＢＬｓ由质粒介导，由普通的β－内酰胺酶基因（ＴＥＭ－１、ＴＥＭ－２、ＳＨＶ－１）突变而来［１］，是一类能水解氧亚氨基β－内酰胺类抗生素，可被β－内酰胺酶抑制剂所抑制的β－内酰胺酶，属于Ｂｕｓｈ－Ｊａｃｏｂｙ－Ｍｅｄｅｉｒｏｓ的最新分类法中的２ｂｅ群。主要由克雷伯菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）和大肠埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）产生，也可由其他肠杆菌科细菌、不动杆菌以及铜绿假单胞菌产生。根据基因同源性的不同，将ＥＳＢＬｓ分为５类，ＴＥＭ型、ＳＨＶ型、ＣＴＸ－Ｍ型、ＯＸＡ型和其他型，ＣＴＸ－Ｍ型又可细分为ＣＴＸ－Ｍ－１组、ＣＴＸ－Ｍ－２组、ＣＴＸ－Ｍ－８组、ＣＴＸ－Ｍ－９组［２－４］。不同国家、不同地区用药的差别导致各地产ＥＳＢＬｓ肠杆菌科细菌的耐药性和流行基因均有不同。
　　本研究对银川市产ＥＳＢＬｓ肠杆菌科细菌的耐药性及ＣＴＸ－Ｍ型基因的分布进行了分析。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１菌株２００６年５～９月从宁夏地区两家三级甲等医院收集分离产ＥＳＢＬｓ菌株，经Ｖｉｔｅｋ－３２型全自动微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司）的Ｖｉｔｅｋ－ＧＮＩ鉴定卡统一进行鉴定，得到大肠埃希氏菌３４株，肺炎克雷伯菌（Ｋ. ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）１１株。
　　１．１．２ 试剂头孢噻肟（３０ μｇ／片）、头孢噻肟／克拉维酸（３０／１０ μｇ／片）、头孢他啶（３０ μｇ／片）、头孢他啶／克拉维酸（３０／１０ μｇ／片）、头孢曲松（３０ μｇ／片）、氨曲南（３０ μｇ／片）、奥格门丁（２０／１０ μｇ／片）等药敏纸片；奈替米星（ＮＥＴ）、加替沙星（ＧＡＴ）、卡那霉素（ＫＡＮ）、磺胺甲�唑（ＳＭＸ）、头孢噻肟（ＣＴＸ）、头孢曲松（ＣＲＯ）、头孢噻吩（ＣＦ）、头孢他啶（ＣＡＺ）、氨苄西林（ＡＭＰ）、美罗培南（ＭＥＭ）等抗生素标准品及Ｍ－Ｈ肉汤和Ｍ－Ｈ琼脂培养基均购自北京天坛药物生物技术公司。
　　１．１．３仪器ＭＪ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＰＴＣ－２００型ＰＣＲ仪、ＢＩＯ－ＲＡＤ凝胶成像仪、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ ６８０型酶标仪等。
　　１．２方法
　　１．２．１菌株的ＭＩＣ和耐药性分析按ＮＣＣＬＳ推荐的微量肉汤稀释法［５］测定各抗生素对实验菌株的最低抑菌浓度（ＭＩＣ），考察各菌株的耐药性。以大肠埃希氏菌ＡＴＣＣ２５９２２和肺炎克雷伯菌ＡＴＣＣ７００６０３为标准质控菌株。
　　１．２．２ＣＴＸ－Ｍ基因型鉴定①ＰＣＲ扩增：根据ＧｅｎＢａｎｋ登录的各型ＥＳＢＬｓ基因序列设计合成ＣＴＸ－Ｍ－１、ＣＴＸ－Ｍ－２、ＣＴＸ－Ｍ－８、ＣＴＸ－Ｍ－９ ４对特异性引物（表１），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，以碱裂解法抽提的４５株待检菌株的质粒为模板，ＰＣＲ反应以５０ μＬ体系进行，其产物进行含０．５ μｇ／ｍＬ ＥＢ的１．２％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪照相。②基因序列测定及比对：将凝胶电泳确定的ＥＳＢＬｓ阳性ＰＣＲ产物纯化后送到上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将所测序列在基因数据库中比对分析，确认其基因型。
　　２结果
　　２．１产ＥＳＢＬｓ菌株的耐药性ＭＩＣ
　　由表２可见，产ＥＳＢＬｓ的大肠埃希氏菌和克雷伯氏菌对美罗培南全部敏感，对头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩、奈替米星和卡那霉素的耐药率均高于６４．００％，对磺胺甲�唑和氨苄西林的耐药率均为１００．００％；对于加替沙星，产ＥＳＢＬｓ的大肠埃希氏菌耐药率为８５．２９％，而产ＥＳＢＬｓ的克雷伯氏菌耐药率为３６．３６％；对于头孢他啶，产ＥＳＢＬｓ的克雷伯氏菌耐药率为６３．６４％，产ＥＳＢＬｓ的大肠埃希氏菌耐药率为２３．５３％。质控菌株的结果符合ＮＣＣＬＳ标准。
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　　２．２．１ＰＣＲ扩增结果琼脂糖凝胶电泳对ＰＣＲ扩增产物检测的结果显示共扩增得到５１条ＥＳＢＬｓ阳性条带，包括２２条ＣＴＸ－Ｍ－１组基因（４３．１４％），２９条ＣＴＸ－Ｍ－９组基因（５６．８６％）。未发现ＣＴＸ－Ｍ－２、ＣＴＸ－Ｍ－８的扩增产物，图１是部分ＣＴＸ－Ｍ－１、ＣＴＸ－Ｍ－９组基因扩增产物电泳结果。
　　２．２．２产ＥＳＢＬｓ菌株主要基因型分布测序结果显示２２株ＣＴＸ－Ｍ－１组中有１２株为ＣＴＸ－Ｍ－２８型，有４株ＣＴＸ－Ｍ－２２型，有３株ＣＴＸ－Ｍ－１５型，有２株ＣＴＸ－Ｍ－３型，有１株ＣＴＸ－Ｍ－５５型；２９株ＣＴＸ－Ｍ－９组全部为ＣＴＸ－Ｍ－１４型。
　　所检测的４５株细菌中，有４１株产ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ，占所有菌株的９１．１１％，其中３１株细菌产单个ＥＳＢＬｓ基因型，包括１９株产ＣＴＸ－Ｍ－１４型，７株产ＣＴＸ－Ｍ－２８型，２株产ＣＴＸ－Ｍ－１５型，产ＣＴＸ－Ｍ－３型、ＣＴＸ－Ｍ－２２型、ＣＴＸ－Ｍ－５５型各１株；１０株细菌同时产２种ＥＳＢＬｓ基因型，包括５株产ＣＴＸ－Ｍ－２８＋ＣＴＸ－Ｍ－１４型，３株产ＣＴＸ－Ｍ－２２＋ＣＴＸ－Ｍ－１４型，产ＣＴＸ－Ｍ－３＋ＣＴＸ－Ｍ－１４型、ＣＴＸ－Ｍ－１５＋ＣＴＸ－Ｍ－１４型各１株。４１株产ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ菌株的具体基因型分布见表３。
　　３讨论
　　３．１产ＥＳＢＬｓ菌株的耐药性
　　产ＥＳＢＬｓ大肠埃希氏菌株和克雷伯氏菌株不仅对第一、三代头孢菌素耐药，而且对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类等交叉耐药。抗菌药物的大量使用是形成细菌多重耐药性的重要诱因，这可能与各地区的用药习惯有关。目前认为碳青霉烯类抗生素如美罗培南是治疗产ＥＳＢＬｓ菌感染的首选药物。本实验药敏结果亦显示其对产ＥＳＢＬｓ大肠埃希氏菌株和克雷伯氏菌株有良好的抗菌活性，敏感率均为１００％，可作为治疗产ＥＳＢＬｓ菌株的首选药物；第三代头孢菌素类药物头孢他啶对产ＥＳＢＬｓ大肠埃希氏菌株的抗菌活性只有76．47％，喹诺酮类抗生素加替沙星对产ＥＳＢＬｓ克雷伯氏菌株的抗菌活性只有63．64％，与国内的一些报道有些差异，这可能与产ＥＳＢＬｓ大肠埃希氏菌株和克雷伯氏菌株的基因型和广谱酶的产生量有关，也可能与宁夏地区临床治疗所使用的药物有关；产ＥＳＢＬｓ大肠埃希氏菌株和克雷伯氏菌株对氨苄西林、头孢噻吩、头孢曲松、头孢噻肟、磺胺甲�唑、卡那霉素、奈替米星的耐药率均在６４％以上，故建议在治疗此类感染时应尽量避免上述种类抗生素的使用。
　　３．２产ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ菌株的基因型
　　ＣＴＸ－Ｍ型ＥＳＢＬｓ含有多种型别，世界各地区流行的型别有所不同。西班牙主要流行ＣＴＸ－Ｍ－９、ＣＴＸ－Ｍ－１０、ＣＴＸ－Ｍ－１４［６－８］；日本、台湾流行ＣＴＸ－Ｍ－３［9-11］；中国主要流行ＣＴＸ－Ｍ－９组ＥＳＢＬｓ［１２－１４］，未发现ＣＴＸ－Ｍ－２组和ＣＴＸ－Ｍ－８组ＥＳＢＬｓ，与本实验结果相符。北京地区以产ＣＴＸ－Ｍ－３ ＥＳＢＬｓ菌株最多，而浙江、新疆及郑州主要是产ＣＴＸ－Ｍ－１４ ＥＳＢＬｓ，地区之间基因型的差别可能是由于各地区抗菌药物的使用不同及医院内携带ＥＳＢＬｓ基因耐药质粒的流行有关［１５］。
　　产ＥＳＢＬｓ大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌一般只携带一种ＣＴＸ－Ｍ基因型，近年来已有关于同时携带两种或两种以上ＣＴＸ－Ｍ基因型菌株的报道［１３，１４］。在本研究中，４１株产ＥＳＢＬｓ基因的菌株有３１株携带一种ＣＴＸ－Ｍ基因型，１０株携带两种ＣＴＸ－Ｍ基因型，这也可能是导致宁夏地区产ＥＳＢＬｓ大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌存在多重耐药性的原因。研究结果表明，随着β－内酰胺类抗生素特别是第三代头孢菌素的不断增量使用，监测产ＣＴＸ－Ｍ型、ＴＥＭ型、ＳＨＶ型和其他型ＥＳＢＬｓ的菌株有重要意义，尤其要密切监视ＣＴＸ－Ｍ型基因的突变和传播，从而为临床合理使用抗生素提供可靠的依据。
　　
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