【大鼠pEGFP-C3/BMP-2真核表达载体的构建】 真核表达载体
[摘要] 目的 通过克隆大鼠的BMP2基因，构建EGFP-C3/BMP2基因的真核细胞表达载体。 方法 把大鼠的基因组DNA通过PCR获得BMP2，克隆构建载体pEGFP/C3-BMP2，并将其转化到大肠杆菌里面，最后进行重组真核表达载体pEGFP-C3-BMP2的构建和鉴定，并可观察其在真核细胞中的表达。 结果 以大鼠总DNA为模板扩增出1 200 bp左右的特异性条带，测序结果与Gene-Bank测序结果相比，翻译成的氨基酸序列相同并完全一致，并可在真核细胞中表达。对重组质粒pEGFP-C3/BMP2进行双酶切鉴定并测序，结果也完全一致。 结论 为进一步研究利用BMP2基因修饰骨组织工程骨，促进骨折愈合再生提供实验基础。
[关键词] BMP2基因；PCR；真核表达载体构建
[中图分类号] R523 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）07（a）-0018-03
Construction of rat pEGFP-C3/BMP-2 recombinant eukaryotic expressing vector
SUN Xin ZENG Rong GUO Weitao XIAO Qixian WANG Bin HUANG Yun LIN Hao
Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Guangdong Province, Zhanjiang 524001, China
[Abstract] Objective To construct a recombinant eukaryotic expressing vector pEGFP-C3/BMP-2 by using rat bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) gene clone. Methods BMP-2 was amplified with PCR and cloned into pEGFP-C3 vector after sequencing, recombinant eukaryotic expressing vector pEGFP-C3/BMP-2 was constructed and identified by sequencing, the expression of BMP-2 in eukaryotic cells was observed and analyzed. Results The sequencing of BMP-2 gene from the rat complied with the Gene-Bank result and with the same amino acid sequence after translation. The recombinant expressing vector pEGFP-C3/BMP-2 was confirmed by double enzyme digestion and sequencing, the successful expression of BMP-2 in eukaryotic cells was observed. Conclusion For the further study BMP2 genetic modification of bone tissue engineering, and promote the regeneration of fracture healing to provide the basis.
[Key words] Bone morphogenetic protein 2 gene; PCR; Eukaryotic expressing vector construction
1965年，Urist[1]发现脱钙骨基质的提取物在肌肉内使间充质细胞转化为骨系细胞发生异位成骨，随后分离出了一种小分子量的糖蛋白，即骨形态发生蛋白（human bone morphogeneticprotein，BMP）。Wezney等[2]在1988年对这种骨提取物的肽链进行分析，并测出其氨基酸的序列，首次克隆出BMP2、BMP3、BMP4，至今，已有15种BMP及40种BMP相关蛋白被成功分离。BMP2属于转化生长因子B超家族中的一员，具有多种生物学功能，可以诱导未分化的间充质干细胞向软骨细胞和成骨细胞分化，诱导肌源性细胞、成骨前体细胞等向骨细胞系分化，进而形成新骨，在骨折和骨损伤修复过程中发挥着重要作用[3-5]。
绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）是一种能发出绿色荧光的报告分子，具有无需加任何底物、荧光性质稳定、相对分子质量小、对细胞无毒性的特点，常用于插入载体中与目的基因一起表达融合蛋白，通过检测荧光的位置及强度来了解目的基因的表达及定位[6-8]。本研究拟通过研究表达载体pEGFP-C3和BMP2片段组成真核表达载体pEGFP-C3/BMP2，进一步了解BMP2及pEGFP-C3的功能与作用，为下一步说明BMP2促进骨愈合奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 雌性SD大鼠12只，质量120～150 g，购自广东医学院实验动物中心。
1.1.2 质粒、载体和受体菌 菌株、质粒以及表达载体，均为本实验室保存。大肠杆菌、感受态菌株DH5α为本实验室自备。Mouse BMP2 Xho1F和Mouse BMP2 Kpn1R购自广州英俊公司。
1.1.3 试剂与工具酶 限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ购自Fermentas of Canada公司，质粒提取试剂盒和DNA 回收纯化试剂盒购自Axygen of USA公司，DL2000 DNA Marker、酵母提取物、蛋白胨、琼脂糖、琼脂粉均购自宝生物（大连）公司。